Три дезоксирибонуклеотида – dАТФ, dГТФ, dЦТФ сразу после синтеза используются для синтеза ДНК.
Однако известно, что в составе ДНК нет уридиловых нуклеотидов, поэтому dУДФ не превращается в dУТФ, а идет на образование тимидилового нуклеотида. Участие в этом принимает фермент тимидилатсинтаза. Донором метильной группы является производная фолиевой кислоты N5,N10-метилен-ТГФК.

Реакция синтеза ТМФ
Далее тимидилмонофосфат в фосфотрансферазных реакциях фосфорилируется с образованием тимидилтрифосфата (ТТФ).

Реакции фосфорилирования тимидиловых нуклеотидов
Ресинтез N5,N10-метиленТГФК
Важным элементом реакции синтеза ТМФ является участие N5,N10-метилен-тетрагидрофолиевой кислоты в качестве источника метильной группы. После реакции остается дигидрофолиевая кислота, которую необходимо вернуть в восстановленную форму тетрагидрофолата и присоединить метиленовую группу. В этом процессе участвуют два фермента: дигидрофолатредуктаза и серин-оксиметилтрансфераза.

Реакции ресинтеза N5,N10-метилен-тетрагидрофолиевой кислоты
Фермент серин-оксиметилтрансфераза также играет роль в обмене серусодержащих аминокислот метионина и цистеина.
Механизм противомикробного действия сульфаниламидов
Целая группа антибактериальных препаратов способна подавлять синтез ТТФ в микробных клетках благодаря структурной схожести пара-аминобензойной кислоты (компонента ТГФК) и вещества сульфаниламида.
При синтезе фолиевой кислоты (витамин В9) микробной клеткой сульфаниламид конкурирует за активные центры фермента с пара-аминобензойной кислотой, что нарушает синтез фолатов бактерией. В результате снижается количество ТГФК в клетке, снижается образование тимидилтрифосфата, тормозится синтез ДНК и размножение микроорганизмов. При терапии побочные эффекты сульфаниламидов также связаны с замедлением синтеза ДНК.
Ингибиторы синтеза тимидилового нуклеотида
Исключительная роль тимидилатсинтазы и фолиевой кислоты в синтезе ТМФ обусловила поиск и использование ингибиторов этой реакции для прекращения синтеза тимидилового нуклеотида и, как следствие, блока синтеза ДНК, что нашло применение в противоопухолевой терапии ("бестиминовая смерть").
Фторурацил – противоопухолевое (цитостатическое) средство, механизм его действия определяется превращением в 5-фтор-производные dУМФ и dУТФ, конкурентно ингибирующих фермент тимидилатсинтазу, что ведет к снижению репликации ДНК из-за недостатка ТМФ. Метотрексат, аминоптерин, триметоприм являются ингибиторами дигидрофолатредуктазы, что препятствует ресинтезу ТГФК и лишает реакцию кофермента.
Mеханизм действия 5-фторурацила определяется его превращением в 5-фтор-дезоксиуридинмонофосфат (5-FdУМФ) и 5-фторуридинтрифосфат (5-FУТФ). 5-FdУМФ – конкурентный ингибитор фермента тимидилатсинтазы.

Азидотимидин (зидовудин) при синтезе ДНК на матрице ретровирусной РНК встраивается вместо dТТФ, т.к. вирусная ДНК-полимераза ("обратная транскриптаза") обладает большим сродством к нему, чем к естественному субстрату dТТФ.