Приготовление гомогената ткани

Хотя исследование гомогенатов тканей практически не применяется в клинико-диагностических лабораториях, оно широко используется для научных целей в экспериментальных работах, также может проводиться исследование биопсийного материала и кусочков ткани, взятой во время операции.

Целью гомогенизации является разрушение тканевой структуры клеточных стенок и/или мембран. Гомогенат ткани может быть использован как материал для исследования активности ферментов, содержания различных метаболитов, а также для дальнейшего фракционирования клеточных компонентов.

Выбор метода разрушения клеточной структуры и среды суспендирования зависит от ткани, а также от целей исследования.

Навеску ткани, отмытую от крови, быстро измельчают ножницами или пропускают через металлический пресс, иногда растирают в ступке с кварцевым песком (мышечная и соединительная ткань). Все процедуры проделываются максимально быстро и на холоду.

Для приготовления гомогенатов тканей из таких органов, как печень, селезенка, тимус с целью максимального сохранения клеточных структур чаще всего используют стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком типа Поттера и Даунса — соответственно с ручным или механическим приводом.

Эффективность гомогенизации зависит от: скорости вращения пестика (800-1000-2000 об/мин), зазора между пестиком и стаканом (обычно 0,14-0,16 мм), количества движений пестика вверх-вниз (8-10 движений) и времени гомогенизации (0,5-1,5 мин). Стакан гомогенизатора обязательно помещается в ледяную баню, полученный гомогенат фильтруют через один слой капрона или 3-4 слоя марли, чтобы отделить неразрушенные кусочки ткани.

Результат гомогенизации можно контролировать морфологически с использованием так называемых "витальных" красителей типа акридинового оранжевого, определяя процент неразрушенных клеток, или биохимически, определяя активность ферментов цитозоля и субклеточных частиц.

К другим методам разрушения тканевой и клеточной структуры относятся: действие осмотического шока, многократное замораживание-оттаивание, обработка ферментами (трипсин, лизоцим, β-гиалуронидаза, липаза), обработка органическими растворителями (толуол, этилацетат), ультразвуком, высоким давлением.

Среда суспендирования для гомогенизации тканей обычно имеет нейтральное значение pН и необходимое осмотическое давление, предохраняющее частицы от набухания и разрыва. Готовится она чаще всего на основе буферного раствора (обычно трис-HCl, pH=7,4) с добавлением 0,25 М сахарозы или 0,2 М KCl. Иногда добавляют вещества, препятствующие инактивации ферментов (например, этилендиаминтетраацетат — ЭДТА, связывающий двухвалентные ионы металлов или глутатион, препятствующий переокислению липидных компонентов).

Соотношение ткань/среда (вес/объем) может быть различным. Обычно готовят исходный 10% гомогенат (1 г ткани на 9 мл среды).

Вы можете спросить или оставить свое мнение.