Лактатдегидрогеназа

Лактатдегидрогеназа (L‑лактат:НАД‑оксидоредуктаза, ЛДГ, КФ 1.1.1.27) является гликолитическим ферментом и катализирует следующую реакцию:

Лактат + НАД Лактатдегидрогеназа Пируват + НАДН

Молекула ЛДГ представляет собой тетрамер, состоящий из одного или двух типов субъединиц, обозначаемых как M (англ: muscle) и H (англ: heart). В сыворотке крови фермент существует в пяти молекулярных формах, различающихся по первичной структуре, кинетическим свойствам, электрофоретической подвижности (ЛДГ‑1 быстрее движется к аноду по сравнению с ЛДГ‑5, то есть более электрофоретичеки подвижна). Каждая форма имеет характерный полипептидный состав: ЛДГ‑1 состоит из 4 H‑субъединиц, ЛДГ‑2 — из 3 H‑субъединиц и 1 M‑субъединицы, ЛДГ‑3 представляет собой тетрамер из 2 H‑субъединиц и 2 M‑субъединиц, ЛДГ‑4 содержит 1 H‑субъединицу и 3 M‑субъединицы, ЛДГ‑5 состоит только из M‑субъединиц.

По степени убывания общей каталитической активности энзима все органы и ткани располагаются в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови.

От того, какой изофермент наиболее представлен, зависит преимущественный способ окисления глюкозы в ткани: аэробный (до CO2 и H2O) или анаэробный (до молочной кислоты). Подобное различие обусловлено разной степенью сродства изоферментов к пировиноградной кислоте. Изоферменты, содержащие в основном H‑субъединицы (ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2), обладают низким сродством к пирувату и поэтому неспособны эффективно конкурировать за субстрат с пируватдегидрогеназным комплексом. В результате пируват подвергается окислительному декарбоксилированию и в виде ацетил‑КоA вступает в цикл Кребса. Напротив, изоферменты, обладающие главным образом M‑субъединицами (ЛДГ‑4 и ЛДГ‑5), имеют более высокое сродство к пирувату и, как следствие, превращают его в молочную кислоту. Для каждой ткани установлены наиболее типичные изоферменты. Для миокарда и мозговой ткани основным изоэнзимом является ЛДГ‑1, для эритроцитов, тромбоцитов, почечной ткани — ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2. В легких, селезенке, щитовидной и поджелудочной железах, надпочечниках, лимфоцитах преобладает ЛДГ‑3. ЛДГ‑4 находится во всех тканях с ЛДГ‑3, а также в гранулоцитах и мужских половых клетках, в последних дополнительно обнаруживается ЛДГ‑5. В скелетных мышцах изоферментная активность располагается в порядке убывания в ряду: ЛДГ‑5, ЛДГ‑4, ЛДГ‑3. Для печени наиболее характерен изофермент ЛДГ‑5, выявляется также ЛДГ‑4.

В норме основным источником активности ЛДГ в плазме крови являются разрушающиеся клетки крови. В сыворотке активность изоферментов распределяется следующим образом: ЛДГ‑2 > ЛДГ‑1 > ЛДГ‑3 > ЛДГ‑4 > ЛДГ‑5. При электрофорезе между фракциями ЛДГ‑3 и ЛДГ‑4 иногда обнаруживается дополнительная полоса изофермента ЛДГ‑X, данный изофермент локализован в тех же органах, что и ЛДГ‑5.

Для определения общей активности ЛДГ в сыворотке крови используют две группы методов:

1. Спектрофотометрические, основанные на прямом оптическом тесте Варбурга: различие в разности поглощения окисленной и восстановленной форм НАД.

2. Колориметрические:

  • динитрофенилгидразиновые, базирующиеся на исследовании содержания пирувата с помощью 2,4‑динитрофенилгидразина:
◊ из методов этой группы наиболее точным и чувствительным является метод Нательсона, состоящий в определении концентрации непрореагировавшего в реакции пирувата. Однако вследствие нестабильности раствора пировиноградной кислоты метод не получил широкого распостранения.
◊ метод Севела и Товарека, заключающийся в определении количества образовавшегося пирувата.
  • редоксиндикаторные методы — точны и просты технически, в них используется способность некоторых веществ (индикаторов) менять цвет в реакциях окисления‑восстановления.

Для определения активности изоферментов ЛДГ наиболее распостраненным является электрофоретическое разделение на ацетате целлюлозы и агарозе. Наиболее простыми и быстро выполнимыми являются методы, основанные на различном отношении ЛДГ‑1 и ЛДГ‑5 к температуре, но для получения воспроизводимых результатов требуется точное соблюдение температурных условий, так как у всех изоферментов имеется некоторая тепловая нестабильность. Методы, основанные на химическом ингибировании изоферментов мочевиной или лактатом дают недостаточно достоверные результаты. Хроматографические методы основаны на разной степени адсорбции изоферментов ЛДГ на сефадексе. Возможно определение изоферментов по выбору оптимальной концентрации субстрата для каждого изофермента.

В качестве унифицированных методов определения общей активности ЛДГ выбраны метод по оптимизированному оптическому тесту и метод Севела‑Товарека; для изучения изоферментной активности — электрофорез на ацетате целлюлозы.

Определение общей активности лактатдегидрогеназы
в сыворотке крови методом Севела‑Товарека

Принцип

Пировиноградная кислота, образованная в результате ферментативной реакции, в щелочной среде взаимодействует с 2,4‑динитрофенил­гидразином и образует окрашенный комплекс.

Нормальные величины

Сыворотка (указанный метод) 220‑1100 нмоль/с×л или
 13‑67 МЕ
(оптический тест) 140‑320 МЕ

Определение активности фракций ЛДГ
с помощью термоингибирования

Принцип

Ферменты, с преимущественным содержанием М‑субъединиц (ЛДГ‑4 и ЛДГ‑5) более термолабильны по сравнению с изоферментами, содержащими H‑субъединицы (ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2).

Нормальные величины

Сыворотка при 56°С инактивация на 30%
при 65°С инактивация на 80%

Определение активности фракций ЛДГ
по инактивации мочевиной

Принцип

Заключается в ингибировании мочевиной активности изофермента ЛДГ‑5 почти на 100%.

Нормальные величины

Сыворотка (ингибирование мочевиной)   25‑36% общей активности
(электрофорез на ацетате целлюлозы) ЛДГ‑1 19‑29% общей активности
ЛДГ‑2 23‑37% общей активности
ЛДГ‑3 17‑25% общей активности
ЛДГ‑4  8‑17% общей активности
ЛДГ‑5  8‑18% общей активности

Влияющие факторы

Наркотические анальгетики и другие обезболивающие препараты, этанол, дикумарин завышают результаты исследования. Необходимо избегать гемолиза, так как в эритроцитах активность фермента выше, чем в сыворотке. Оксалаты и мочевина ингибируют фермент.

Клинико‑диагностическое значение

Все заболевания, протекающие с разрушением клеток, сопровождаются резким повышением активности ЛДГ в сыворотке крови. Нарастание общей активности фермента обнаруживается при таких заболеваниях как инфаркт миокарда, некротическое поражение почек, гепатит, панкреатит, воспаление и инфаркт легкого, опухоли различной локализации, повреждения, дистрофия и атрофия мышц, гемолитические анемии и физиологическая желтуха новорожденных, лимфогранулематоз, лейкозы. При инфаркте миокарда начало роста активности фермента в сыворотке крови отмечается на 8‑10 час от момента приступа, максимальное увеличение наступает к 24‑48 часу, нередко в 15‑20 раз превышая норму. Повышенная активность ЛДГ сохраняется до 10‑12 суток от начала заболевания. Степень нарастания активности фермента не всегда коррелирует с размерами поражения сердечной мышцы и для прогноза исхода заболевания может являться лишь ориентировочным фактором. У больных стенокардией активность фермента не изменяется, что позволяет применять тест для дифференциальной диагностики в пределах 2‑3 суток после сердечного приступа.

Наличие органной специфичности ферментов позволяет применять исследование их активности с целью топической диагностики .

Общая активность и изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в сыворотке крови при некоторых заболеваниях
Заболевание Общая
активность
ЛДГ
Изоферменты
ЛДГ‑1 ЛДГ‑2 ЛДГ‑3 ЛДГ‑4 ЛДГ‑5
Инфаркт миокарда ++ + +      
Заболевания легких +     + +  
Вирусный гепатит +       + +
Токсический гепатит +       + +
Цирроз печени +       + +
Миелолейкоз ++   + +    
Гранулоцитоз ++   + +    
Разрушение тромбоцитов
(эмболии, гемотрансфузии)
+   + + +  
Панкреатит +   + +    
Мегалобластическая анемия +++ + +      
Гемолитическая анемия +++ + +      
Почечные заболевания ++ + +      
Миопатия ++ + +      

При заболеваниях печени сыворотка после инкубации при 56°С теряет около 50% своей активности, при 65°С — до 90%. При сердечных поражениях инактивация при 56°С достигает 10%, при 65°С — около 60%. Активность мочевиностабильной фракции при заболеваниях печени снижается до 20% от общей, инфаркт миокарда сопровождается возрастанием свыше 40% активности данной фракции. 

Вы можете спросить или оставить свое мнение.