Основы энзимодиагностики

Изменения в специфических ферментативных процессах могут быть причиной или следствием различных патологических состояний. Большинство ферментативных процессов локализованы внутри клеток, но определение активности ферментов вне клеточной среды (сыворотка, плазма, слюна, моча) может иметь диагностическое значение.

Для трактовки результатов необходимо знать:

  • Является данный фермент органоспецифичным или плазмоспецифичным;
  • Внутриклеточную локализацию фермента (мембранный, цитоплазматический, митохондриальный и т.п.);
  • Скорость синтеза фермента, скорость секреции из клеток и удаления из внеклеточной жидкости путем инактивации, разрушения и экскреции;
  • Наличие в биологическом материале активаторов и ингибиторов этого фермента;
  • Наличие фармакологической и ятрогенной интерференции.

Для того, чтобы скорость реакции зависела только от концентрации фермента при постановке ферментативной реакции необходимо выполнять следующие условия:

  • Определять активность фермента в самом начале реакции в условиях достаточного насыщения его субстратом (субстрат должен быть в избытке). При этом концентрация продуктов реакции недостаточна для того, чтобы началась обратная реакция, отсутствуют разрушение фермента в ходе процесса и возможное ингибирование фермента продуктами реакции;
  • Выдерживать оптимальную температуру (или температуру, указанную в методике) и pH среды, точную концентрацию и вид буфера, учитывать кинетические характеристики фермента.

При выборе материала исследований необходимо учитывать:

  • Наличие исследуемых ферментов в клетках крови и возможность их освобождения при гемолизе, что исказит результаты исследования;
  • Для большинства ферментов не имеет значения, определяется их активность в плазме или в сыворотке крови, но это имеет значение для тех, которые содержатся в тромбоцитах (кислая фосфатаза, лактатдегидрогеназа), так как при свертывании крови указанные ферменты будут освобождаться из тромбоцитов и ферментативная активность в сыворотке крови будет выше, чем в плазме.
  • При разведении биологической жидкости активность фермента изменяется не всегда пропорционально, вследствие нарушения естественной среды фермента (белково-липидное окружение) и соотношения активаторов и ингибиторов.
  • Определять активность фермента следует в свежем биологическом материале. При хранении активность многих ферментов снижается.
Уменьшение активности ферментов в сыворотке при хранении
Ферменты Температура хранения
20‑25°С 2‑8°С
Аланинаминотрансфераза 3 дня — 17% 3 дня — 10%
Аспартатаминотрансфераза 3 дня — 10% 3 дня — 8%
Альдолаза 5 дней — 15% 5 дней — 8%
α‑Амилаза 5 дней — без снижения 5 дней — без снижения
Холинэстераза 7 дней — без снижения 7 дней — без снижения
Креатинкиназа 24 часа — 2% 7 дней — 2%
Креатинкиназа (МВ) 1 час < 10%< 24 часа < 10%
Глутаматдегидрогеназа 3 дня — 15% 3 дня — 5 %
γ-Глутамилтранспептидаза до 7 дней 7 дней — без снижения
Лактатдегидрогеназа 7 дней — 5% 3 дня — 8%
Лактатдегидрогеназа ‑ 1 7 дней — 5% 7 дней — 5%
Кислая фосфатаза 7 дней без снижения
(ста­билизация 0,5% NaHSO4)
7 дней без снижения
(ста­билизация 0,5% NaHSO4)
Щелочная фосфатаза 7 дней — 10% 7 дней — без снижения
Лейцинаминопептидаза о 7 дней> 7 дней — без снижения
Липаза 24 часа 5 дней — без снижения

Примечание: длительное хранение допускается только при очень низкой температуре (–10‑20°С ), при однократном размораживании.

Активность ферментов можно выражать в моль/с×л, мкмоль/с×л, мкмоль/ч×мл, 1 моль/с = 1 катал, в мг/ч×мл, в мккат/л, в мкмоль/мин = 1 Е (или 1 U, 1 unit — стандартная единица фермента), 1 мкмоль/мин×л = 1 Е/л = 1 МЕ (международная единица). Для выражения активности фермента пользуются определением удельной и молекулярной активности. Удельную активность фермента выражают числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в минуту, принято называть числом оборотов, или молекулярной активностью.

Изменение активности ферментов в биологических жидкостях обуславливается рядом причин.

  1. Повышение активности может быть результатом ускорения процессов синтеза (щелочная фосфатаза при рахите, гепатите), некроза клеток, понижения выведения, повышении проницаемости клеточных мембран.
  2. Снижение активности вызывается уменьшением числа клеток, секретирующих фермент (холинэстераза при циррозе печени), недостаточностью синтеза, увеличением выведения фермента, торможением активности (в результате действия протеиназ).
  3. Степень изменения активности исследуемых ферментов зависит от массы пораженного органа, распределения ферментов между тканями, локализации ферментов во внутриклеточных органеллах. Так, аланинаминотрансфераза локализована в цитоплазме, а аспартатаминотрансфераза и в цитоплазме, и в митохондриях, глутаматдегидрогеназа — митохондриальный фермент. При воспалительных процессах в первую очередь выходят цитоплазматические ферменты, при прогрессировании заболевания наблюдается некроз клеток и происходит разрушение органелл.

Большую диагностическую ценность имеет определение не только общей активности ферментов, но и их изоферментов. Изоферментами называются молекулярные формы ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но различающиеся по физико‑химическим и иммунологическим свойствам. Наиболее распространенными методами выявления молекулярных форм фермента является электрофорез, хроматография, иммунная преципитация. Изоферменты обладают разной термостабильностью, чувствительностью к активаторам и ингибиторам, сродством к субстрату. Так, изофермент‑5 лактатдегидрогеназы почти полностью ингибируется мочевиной и щавелевоуксусной кислотой, а лактатдегидрогеназа‑1 является наиболее термостабильной фракцией. Изофермент кислой фосфатазы, характерный для простаты, избирательно ингибируется тартратом, ионами фтора и железа.

В ряде случаев определенное диагностическое значение имеет установление взаимоотношений между изменениями активности отдельных ферментов или получение своеобразных ферментных спектров крови. При этом удается установить достоверные ферментные симптомы отдельных заболеваний. Например, острые гепатиты характеризуются резким увеличением активности аланин‑ и аспартатаминотрансфераз и альдолазы. При механических желтухах характерным является нарастание содержания щелочной фосфатазы без большого увеличения активности аминотрансфераз и альдолазы.

Наличие и активность фермента можно учесть по его действию в определенных условиях, по скорости накопления продукта или исчезновения субстрата данной ферментативной реакции. Для этого применяются самые разнообразные методы:

Химические методы, основаны на количественном учете химических групп или веществ, образующихся (исчезающих) в растворе в результате действия фермента;

  1. Газометрические методы;
  2. Поляриметрические методы;
  3. Хроматографические методы — путем количественной хроматографии исследуют величину накопления продукта реакции или убыли субстрата; также при помощи хроматографии разделяют изоферменты и определяют в дальнейшем их активность;
  4. Вискозиметрические методы;
  5. Методы электрометрического титрования;
  6. Спектрофотометрические и колориметрические методы — наиболее широко применяемые в настоящее время.

Также существуют методические принципы определения активности ферментов, различающиеся по способу измерения активности ферментов:

  1. Непрерывное кинетическое измерение — прямое непрерывное измерение скорости ферментативной реакции в начальной линейной части кривой при оптимизированной концентрации реактивов. Способ широко используется в автоматических анализаторах. Наиболее точными и приемлемыми являются спектрофотометрические методы, основанные на оптическом тесте Варбурга и использующие различную величину поглощения при 340 нм окисленной (поглощение отсутствует) и восстановленной (мак­симальная абсорбция) форм НАД.

Прямой оптический тест применяется для определения НАД‑зависимых дегидрогеназ (лактатдегидрогеназы, сорбитдегидрогеназы), например для ЛДГ по реакции:

Пируват + НАДH ↔ Лактат + НАД

Непрямой тест требует введения дополнительных сопряженных дегидрогеназных реакций (см "Аминотрансферазы").

  1. Двухточечное измерение — активность фермента определяется по измерению величины накопления продукта (или убыли субстрата) за определенный промежуток времени на начальном этапе реакции.
  2. Измерение по конечной точке (метод постоянного времени) — измеряется концентрация продукта после остановки реакции в определенный момент времени с помощью ингибитора либо физической инактивации фермента.

Вы можете спросить или оставить свое мнение.