Клиническая химия гормонов располагает широчайшим спектром методов исследования:
- прямые физико-химические методы (спектрофотометрические, колориметрические, газо- и жидкостно хроматографические, флюориметрические, полярографические и др.),
- биологические пробы in vivo и in vitro (требуют наличия вивария и спецоборудования),
- методики, основанные на связывании гормонов с антителами, транспортными белками крови , рецепторным аппаратом клеток-мишеней (обеспечивают высокую специфичность исследования).
Для количественной характеристики гормонов в настоящее время используется принцип мечения радиоактивным изотопом, ферментом, флюорофором (радиоконкурентные, иммуноферментные, иммунохимические и др. исследования).
Выделяют несколько типов радиолигандного тестирования in vitro:
- РИА (радиоиммунологический анализ) наиболее известен и этот термин часто используют для всех вариантов подобных in vitro методов, что не вполне корректно,
- ИРМА (иммунорадиометрический анализ),
- КБС (конкурентное белковое связывание),
- РРТ (радиорецепторное тестирование),
- РЭА (радиоэнзиматический анализ) и РРА (радиореагентный анализ).
В основу этой терминологии положено обозначение используемых реагентов. Общей основой исследований является конкуренция немеченых ("холодных") молекул определяемого вещества и молекул этого же вещества, соединенных с радиоактивной меткой (125I,3H и др.), за связывание специфическими биндинг-системами. В качестве биндинг-систем могут выступать: иммунная антисыворотка (РИА), специфические тканевые рецепторы (РРТ), белки разных тканей (КБС) и др.
Радиоиммунологические оказались наиболее чувствительными (позволяют определять пикограммовые количества вещества), менее громоздкими (особенно при наличии коммерческих наборов), более воспроизводимыми и достаточно специфичными. Поэтому они чаще всего используются в клинике.
Методические детали проведения радиоиммунного анализа описаны в инструкциях фирм-изготовителей для каждого РИА-комплекта. К ним прилагается истинная калибровочная кривая для каждого конкретного набора на момент его изготовления.
Метод радиоиммунного анализа подразумевает следующие основные этапы:
1. Внесение в пробирку исследуемой пробы или раствора стандарта, меченого антигена, антисыворотки или другого специфического связывающего компонента в присутствии буфера. Для достижения максимальной воспроизводимости результатов гормон всегда определяется в дублях, а калибровочную кривую строят как можно ближе к истинной, для чего используют три параллельные пробы для каждого стандарта. Рекомендуется при выполнении процедур раскапывания сыворотки и компонентов РИА-набора пользоваться автоматическими дозаторами.
2. Инкубация проб в оптимальных для каждого набора условиях, что необходимо для установления динамического равновесия между процессами образования и распада иммунных комплексов;
3. Сепарация связанной и свободной фракции немеченого лиганда с последующим центрифугированием и аспирацией или декантированием супернатанта. Здесь используют широкий спектр методов разделения клиплексов антиген-антитело от непрореагировавших компонентов смеси: фракционное осаждение (этанол, диоксан, полиэтиленгликоль, сульфит натрия, сульфат аммония, трихлоруксусная кислота), адсорбция (активированный уголь, силикаты, гидроксиаппатит), гель-фильтрация (на колонках или добавлением геля в пробирку), электрофорез (крахмальный гель, ацетат целлюлозы. полиакриламидный гель), метод двойных антител (растворимая и твердая фазы), иммобилизованные антитела (на стенках пробирки или на специальных вкладышах).
4. Радиометрия проб и математическая обработка результатов. Большинство наборов для определения гормонов и их метаболитов предполагают осаждение комплекса антиген-антитело и радиометрию осадка (например, при изучении инсулина, кортизола и т.д.) В некоторых случаях иммунный комплекс не осаждается, а адсорбируется на оставшийся свободным лиганд. поэтому определяется радиоактивность надосадочной жидкости (например, при исследовании простагландинов). Радиометрию проб часто совмещают с математической обработкой информации (перевод числа импульсов счета каждой пробы в единицы концентрации) и проводят на гамма-счетчиках, гамма-спектрометрах (при использовании в качестве метки 131I, 125I), а также на бета-сцинтилляционных счетчиках (при использовании в качестве метки 3Н), снабженных пакетом специальных программ компьютерной обработки данных.
Конечные результаты выражают в единицах, рекомендованных фирмами-изготовителями наборов для построения калибровочных кривых из стандартных навесок определяемых веществ.
Пересчет результатов радиометрии проб в единицах концентрации или активности производятся методом построения калибровочной кривой, для чего используются стандарты с известным количеством немеченого соединения. По мере увеличения концентрации лиганда в стандарте количество радиоактивных комплексов уменьшится и, следовательно, снижается радиоактивность получаемого осадка (обозначают стандарты – В). Наибольшей радиоактивностью обладает осадок в пробирках, не содержащих немеченый антиген (так называемый нулевой стандарт – ВО). При построении калибровочного графика по оси ординат откладывают процент связывания метки – отношение (В/ВО)´100%, по оси абсцисс – единицы концентрации (активности) стандартов. Существует несколько способов построения стандартной кривой, из них методом выбора в обработке результатов РИА считается сплайн-интерполяция.
Помимо нулевого стандарта и стандартов гормона используются еще две пробы: Т- тотальная, которая содержит только метку и характеризует ее активность; НСВ – проба на неспецифическое связывание, которая содержит все составные части РИА-набора, кроме антитела, и позволяет определить неспецифическое связывание метки разделяющими компонентами и стенками пробирки.
Неспецифическим связыванием определяемого гормона очень часто обладает сама сыворотка или плазма крови. Если процент неспецифического связывания (отношение НСВ/Т´100%) не превышает 5, то его можно не учитывать, если же он в неизвестных пробах больше 5, то его нужно вычислять для каждой пробы (что очень удорожает исследование) или проводить экстракцию гормона из плазмы крови. Это делается при определении вазопрессина, соматостатина, циклических нуклеотидов, тестостерона, простагландинов и ряда других гормонов и биологически активных веществ.
Однако метод РИА не в состоянии заменить все остальные аналитические методы, а для большой группы стероидных гормонов и их метаболитов химические методы по-прежнему остаются актуальными. Не утратили значения в силу своей специфичности и отдельные биологические методы определения гормонов. В клинической практике просматривается тенденция к комплексным исследованиям, поскольку отдельно взятый тест часто малоинформативен и позволяет судить лишь об одном звене гормональной системы.