Белки, связанные с углеводными группами, составляют обширный класс соединений, в котором выделяют две большие группы:
1. Гликопротеины — белки, содержащие в качестве простетической группы небольшое количество углеводов (до 15%), присоединенных к аминокислотным радикалам ковалентными связями. В составе углеводной части определяются гексозы (галактоза, манноза, редко глюкоза), пентозы (ксилоза, арабиноза), дезоксисахара (фукоза, рамноза), аминосахара (ацетилгалактозамин, ацетилглюкозамин), нейраминовая кислота и ее уксуснокислые эфиры (сиаловые кислоты). Большинство этих белков обладает слабовыраженными кислыми свойствами. В группе гликопротеинов выделяют серомукоиды (серогликоиды), обладающие выраженными кислыми свойствами и растворимых в хлорной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотах. Эта фракция, составляя 1% всех белков сыворотки, включает 12% всех углеводов плазмы.
2. Протеогликаны (мукополисахариды) — гидрофильные соединения, в состав которых входит 20‑80% углеводов. Углеводные компоненты протеогликанов называют гликозаминогликанами. Выделяют 7 типов гликозаминогликанов, из них 5 типов содержат в своем составе глюкуроновую кислоту (к ним относятся гиалуроновая кислота, хондроитин-4‑сульфат и хондроитин-6‑сульфат, гепарин и гепарансульфат), шестой тип (дерматансульфат) содержит идуроновую (галактуроновую) кислоту, седьмой (кератансульфат) — галактозу. Сиаловые кислоты, манноза, ксилоза присутствуют в минимальном количестве. Протеогликаны имеют сильно выраженные кислотные свойства благодаря наличию большого числа карбоксильных групп и остатков серной кислоты.
При исследовании содержания углеводсодержащих белков возможно использование нескольких методических подходов:
1. Определение индивидуальных гликопротеинов острой фазы посредством специфических энзиматических или иммунологических методов.
2. Выявление богатых гликопротеинами электрофоретических фракций.
3. Исследование углеводно-белковых комплексов по их белковой части (турбидиметрические и нефелометрические методы, по тирозину белка).
4. Определение суммы углеводов, связанных с белками. Методы этой группы являются наиболее приемлемыми для биохимических лабораторий. В крови можно определить любой из углеводных компонентов, однако более простым и дешевым является определение сиаловых кислот и связанных с белком гексоз:
- общее количество гексоз, связанных с белком, соответствует содержанию гликопротеинов, а количество серогликоидов определяется по концентрации гексоз, растворимых в хлорной кислоте и нерастворимых в фосфорновольфрамовой кислоте:
| ◊ для определения концентрации гексоз применяется орциновый метод, |
| ◊ для выявления концентрации сиаловых кислот — резорциновый метод и метод с уксуснокислым реактивом. |
- при изучении уровня протеогликанов углеводный компонент предварительно осаждают четвертичными аминами, в частности, цетилтриметиламмонием, затем определяют гликозаминогликаны специфической реакцией:
| ◊ с карбазолом — интенсивнее развивается реакция с глюкуроновой кислотой по сравнению с идуроновой, |
| ◊ с орцином — интенсивность окрашивания глюкуроновой и идуроновой кислот одинакова. |
Различие в окраске после проведения карбазоловой и орциновой реакций позволяет судить об относительном содержании дерматансульфата в пробе. Для чистого образца дерматансульфата отношение содержания гликозаминогликанов по карбазоловой реакции к их концентрации, определенной по орциновой реакции, равняется 0,67. При наличии других гликозаминогликанов (кроме кератансульфата) коэффициент возрастает.
В качестве унифицированных утверждены резорциновый метод определения концентрации сиаловых кислот и орциновый метод определения всех гексоз, входящих в состав гликопротеинов, и гексоз, связанных с серогликоидами.
Резорциновый метод определения концентрации
сиаловых кислот (по Свеннерхольму)
Принцип
При нагревании гликопротеинов плазмы с трихлоруксусной кислотой отщепляются сиаловые кислоты, которые в свою очередь гидролизуются с образованием нейраминовой кислоты. Резорцин в присутствии солей меди в солянокислой среде дает с нейраминовой кислотой синее окрашивание.
Нормальные величины
| Сыворотка | 2,0‑2,33 ммоль/л |
Клинико‑диагностическое значение
Концентрация сиаловых кислот в крови возрастает при различных воспалительных процессах (эндокардите, остеомиелите), при туберкулезе, лейкемии, лимфогранулематозе, нефрозе, резко повышается при опухоли головного мозга, инфаркте миокарда, увеличивается при поражении паренхимы печени, коллагенозах, при других процессах, протекающих с деструкцией соединительной ткани.
Снижение сывороточного уровня сиаловых кислот отмечается у больных с пернициозной анемией, гемохроматозом, болезнью Вильсона и дегенеративными процессами в ЦНС.
Определение содержания серомукоидов и общего
количества гликопротеинов орциновым методом
Принцип
Гликопротеины осаждают вместе с белками сыворотки или плазмы крови спиртом, осадок отмывают, растворяют в щелочи и после гидролиза серной кислотой определяют концентрацию гексоз по реакции с орцином, что соответствует содержанию гликопротеинов.
Для определения серомукоидов белки осаждают хлорной кислотой, при этом серомукоиды не осаждаются. Затем из надосадочной жидкости осаждают серомукоиды при помощи фосфорновольфрамовой кислоты, осадок отмывают и после растворения его в щелочи определяют уровень гексоз.
Нормальные величины
| Гексозы, связанные с гликопротеинами | 5,8‑6,6 моль/л |
| Гексозы, связанные с серомукоидами | 1,2‑1,6 ммоль/л |
Клинико‑диагностическое значение
Количество гексоз гликопротеинов увеличивается при разнообразных воспалительных процессах: туберкулезе, плеврите, пневмонии, остром ревматизме, гломерулонефрите, при диабете, инфаркте миокарда, подагре, злокачественных новообразованиях. Особое значение определение концентрации гликопротеинов имеет при вяло текущих заболеваниях, при этом возрастание активности свидетельствует об активации процесса, хотя клинические симптомы еще могут не проявляться.
Возрастание содержания гексоз серомукоидов наблюдается при всех воспалительных и некробиотических процессах: инфаркте миокарда, злокачественных опухолях, хроническом холецистите, деструктивном туберкулезе легких, ревматизме.
Снижение показателей выявляется при инфекционном гепатите, гепатоцеллюлярной дистрофии, при рассеяном склерозе.
Гликозилированный гемоглобин
Гемоглобин, как и другие белки, при выдерживании его в растворе глюкозы или другого редуцирующего моносахарида, подвергается неэнзиматическому гликозилированию, то есть присоединяет углевод к своей структуре с образованием шиффовых оснований. Степень гликозилирования гемоглобина прямо соответствует времени инкубации и концентрации глюкозы в среде. Таким образом, содержание гликозилированного гемоглобина (обозначается как HbA1c) характеризует средний уровень концентрации глюкозы в крови за 4‑6 недель, то есть за период, соизмеримый с временем жизни молекулы гемоглобина (полупериод распада равен 90‑100 дней).
Выделяют следующие нормальные типы гемоглобина: A1 (составляет 96‑98% всего пула белка), A2 (2‑5%), A3 (<1%), F (1‑2%). Гемоглобин A1 состоит из трех компонентов: HbA1а, HbA1b и HbA1c. Последний компонент представляет собой гликозилированный гемоглобин и дает выраженную корреляцию со степенью сахарного диабета.
Содержание гликозилированного гемоглобина исследуют следующими методами:
1. Хроматографические — наиболее точны, но трудоемки и требуют специальной посуды и реактивов.
2. Электрофоретические — используются различные носители.
3. Химические методы, использующие гидролиз связи между белком и моносахаридным остатком.
Определение уровня гликозилированного гемоглобина
по реакции с тиобарбитуровой кислотой
Принцип
Содержащийся в эритроцитах гемоглобин гидролизуется нагреванием со щавелевой кислотой, при этом из остатков моносахарида образуется 5‑оксиметилфурфурол, количество которого определяют по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Одновременно определяют концентрацию гемоглобина в гемолизате.
Нормальные величины
| Сыворотка | 4,5‑6,1% |
Клинико‑диагностическое значение
Уровень гликозилированного гемоглобина повышается при сахарном диабете и характеризует эффективность терапии. При этом увеличение концентрации HbA1с до 8‑10% свидетельствует о хорошо компенсированном, до 10‑12% — о частично компенсированном, свыше 12% — о некомпенсированном сахарном диабете.
Снижение показателя наблюдается при регенерации крови после кровопотери.