Исследование гормонального статуса имеет большое значение в клинике для:
- диагностики эндокринных расстройств;
- оценки функционального состояния организма при другой патологии;
- изучение эффективности лечебных мероприятий.
Определение гормонального спектра в методическом отношении – наиболее сложный раздел клинической биохимии, которым занимаются специальные лаборатории или отделения крупных лечебных учреждений. В рядовых КДЛ выполняют лишь некоторые наиболее простые химические методы.
При подготовке к данным исследованиям следует учитывать два важных момента: необходимость соблюдения стандартных условий взятия биологического материала и предотвращения деградации гормонов в образцах.
Определение гормонов производят в плазме или сыворотке крови, моче, желчи, слюне, ликворе, биоптатах тканей.
Если не преследуется специальная цель изучить суточный ритм гормональной активности, взятие периферической венозной крови у пациентов производят в условиях физиологического покоя (что особенно важно при исследовании катехоламинов, а также гормонов гипофиза и надпочечников ), утром, натощак в одно и то же время в предварительно охлажденные стеклянные пробирки, которые немедленно помещают в ледяную баню. Структура стероидных гормонов устойчивее пептидных, поэтому кровь для их определения можно брать без охлаждения.
При получении сыворотки возникает опасность того, что при отстаивании и центрифугировании крови из форменных элементов интенсивно освобождаются протеолитические ферменты, разрушающие определяемое вещество. Поэтому для исследования содержания пептидных и белковых гормонов предпочтительнее готовить плазму.
При получении плазмы в клинике обычно используют гепарин, но он блокирует связывание антигена с антителом, а значит, не позволяет использовать радиоиммунохимичесие методы, или цитрат, который существенно меняет кислотность среды. Учитывая это, лучше использовать натриевую соль ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в конечной концентрации 20 мкмоль/л. Препарат в указанной концентрации не влияет на образование комплекса антиген-антитело, и в то же время достаточно эффективно ингибирует протеолиз и активность фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов.
С другой стороны, некоторые исследователи предпочитают сыворотку, так как, например, стероиды экстрагируются из нее легче и полнее, чем из плазмы. Кроме того, плазма нередко образует эмульсию с органическими растворителями во время экстракции гормонов, а также после процедуры замораживания-оттаивания в ней появляются хлопья фибрина, мешающие определению.
Воэможен синтез биологически активных веществ в пробирке, поэтому при взятии крови в таких случаях используют определенные ингибиторы. Например, для предотвращения синтеза простагландинов в пробирку вносят 10 мкл индометацина в конечной концентрации 50 мкмоль/л и гепарина 10 ЕД/мл.
После взятия крови пробы центрифугируют при 2-3 тыс. g в течение 15 минут при температуре 4°С. Немедленно после центрифугирования плазму разливают на аликвоты согласно количеству разных типов тестирования, так, чтобы хватило на два-три параллельных определения. Для предотвращения протеолитического расщепления пептидных гормонов к 2 мл плазмы добавляют 0,1 мл тросилола. Замораживание проб следует проводить очень быстро, лучше в жидком азоте, помещая их в полиэтиленовые пробирки. Чаще плазму замораживают и хранят в низкотемпературных холодильниках при температуре не выше -20°С. Срок хранения биологического материала – около месяца, для стероидов – до нескольких месяцев. Иногда для хранения плазмы используют морозильные камеры бытовых холодильников, в этом случае срок хранения снижается до нескольких суток.
Размораживание и повторное замораживание повреждает практически все биологические пробы. Существует ошибочнон мнение, что такое воздействие не влияет на тиреоидные и стероидные гормоны. Действительно, их структура более устойчива, но основной пул этих гормонов циркулирует в комплексе с транспортными белками, которые очень чувствительны к температурным воздействиям, разрушаются и перестают защищать гормоны от метаболических преобразований.
Определению гормонов часто предшествуют процедуры экстракции анализируемого лиганда из опытного образца и его концентрирования (чаще всего путем высушивания экстракта в вакуумном шкафу при 45‑50°С, желательно в токе азота или какого-то инертного газа). Поскольку при экстрагировании гормонов используют органические растворители, все процедуры проводят в стеклянных, а не в пластиковых пробирках.
Сухие экстракты хранят при температуре -2-8°С до определения. В случае предполагаемого длительного хранения в пробирку с экстрактом перед высушиванием добавляют спиртовый раствор азида натрия в конечной концентрации 0,2% (1 капля). Препарат обладает мощным бактерицидным действием и не влияет на результаты иммунологического, радиолигандного анализов.
Сбор мочи для количественного определения гормонов проводят в течение заданных интервалов времени. На протяжении суток скорость образования и экскреции гормонов с мочой колеблется весьма значительно, но эти колебания нивелируются при исследовании порции суточной мочи.
Мочу собирают без консервантов и хранят в холодильнике при 0-8° С. Если моча не содержит стабилизаторов, как, например, при определении стероидов и их метаболитов, она должна храниться до анализа не более 10 дней в замороженном виде. Для консервации мочи в нее добавляют бактериостатические агенты из расчета на 100 мл мочи – 10 мг тиомерсала, 1 мл водного раствора мертиолата (10 мг/100 мл), 1 мл хлороформа, 10 мл толуола. В лабораториях чаще всего применяют хлороформ. Считают, что в таких условиях пробы могут сохраняться несколько недель.
При определении катехоламинов мочу собирают в сосуд из темного стекла с добавлением кислоты (серной, соляной) или другого стабилизатора (например, фторида натрия). Замороженную мочу со стабилизатором, предназначенную для определения катехоламинов, допускается хранить не более трех дней.
Из рациона пациента, по меньшей мере, за трое суток до сбора мочи, необходимо исключить продукты и лекарственные препараты, являющиеся источником пигментов мочи (свеклу или амидопирин), а также влияющие на мочеотделение. Присутствие в моче некоторых веществ эндо- и экзогенного происхождения может искажать результаты определения гормонов. Например, стильбены мешают определению стероидов мочи. Результаты определения эстриола и 17-ОКС химическими методами в моче больных сахарным диабетом в ряде случаев не отражают истинного содержания этих гормонов из-за влияния глюкозы.