Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:
1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;
2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;
3. Колориметрические диазометоды, базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.
4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;
5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;
6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.
Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.
Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции
Принцип
Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.
Нормальные величины
| Сыворотка (диазореакция) | Прямой билирубин | ||
| Взрослые | 2,2‑5,1 мкмоль/л | ||
| Общий билирубин | |||
| Дети | Доношенные | Недоношенные | |
| кровь из пуповины | < 34,2 мкмоль/л | < 34,2 мкмоль/л | |
| возраст до 2 дней | < 136,8 мкмоль/л | < 205,2 мкмоль/л | |
| возраст до 5 дней | < 205,2 мкмоль/л | < 273,6 мкмоль/л | |
| впоследствии | 3,4‑17,1 мкмоль/л | ||
| Взрослые | 8,5‑20,5 мкмоль/л | ||
| Моча (диазореакция на диагностических полосках или таблетках) |
отсутствие билирубина | ||
| Амниотическая жидкость (метод окисления) | 28 нед | <1,28 мкмоль/л | |
| 40 нед | <0,43 мкмоль/л | ||
| Кал | отсутствует | ||
| Желчь | печеночная | 513,1‑1026,2 мкмоль/л | |
| пузырная | в среднем 2394,6 мкмоль/л | ||
Влияющие факторы
Завышенные результаты вызывает гемолиз, прием стероидных препаратов, эритромицина, фенобарбитала, употребление пищи, содержащей каротиноиды (морковь, абрикосы). Длительное стояние сыворотки на свету вызывает окисление билирубина и занижает значения.
Клинико‑диагностическое значение
Сыворотка
Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:
1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.
У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.
2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.
Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.
В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.
3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.
В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).
В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.
Моча
Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.
Амниотическая жидкость
Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.